Uno de los sistemas más
importantes para la identificación de microrganismos es observar su crecimiento
en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El
material alimenticio en el que crecen los microrganismos es el Medio de Cultivo
y el crecimiento de los microrganismos es el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan
adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y
debe estar exento de todo microrganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas
requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos
orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es
una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros
ingredientes.
El agar es un elemento
solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura
del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas
excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es
atacado por aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante
pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se
encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono,
suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por
dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para
detectar reacciones de fermentación de los microrganismos que ayuden a
identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el
crecimiento de los microrganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan
como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como
inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se
usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La
Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la
mayoría de las bacterias Gram-positivas).
Condiciones
generales para el cultivo de microrganismos
El desarrollo adecuado de los
microrganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores
de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio
medio.
1- disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la
investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno,
azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas
vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar
presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de
electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban
originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos
de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación
a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos
lábiles.
Actualmente, la forma más extendida de
aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además,
representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la
mayoría de los microrganismos, que no suelen utilizar directamente las
proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros
compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades
nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como
suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos
carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio
o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza
vitamínica.
Muy a menudo se añaden al medio de cultivo
ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o
bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos
microrganismos.
2- consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio líquido podemos
modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar,
con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.
Los medios solidificados con gelatina tienen
el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan
adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este
solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso
universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de
medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.
3- presencia (o ausencia) de oxígeno y
otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en
una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno
directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios
estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno
ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen
mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno
muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz
de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
4- condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el
medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las
células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el
mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC
proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria
para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
5- Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen
mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones
evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.
6- pH
La concentración de iones hidrógeno es muy
importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se
desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren
medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o
bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo
inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.
7- Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de
forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen
a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores
(hipertermófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos
de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofitos tienen
rangos más amplios.
8- Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar
perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan
alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de
los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema
clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza
vapor de agua a presión como agente esterilizante)
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